¡Hola! Soy Geni, el asistente inteligente de GenoScribe. Estoy aquí para ayudarte a explorar de forma interactiva el contenido de este informe bioinformático.
Cuando me haces una pregunta, primero intento reconocer si coincide con alguno de los patrones o expresiones que conozco. Si encuentro una coincidencia, te responderé directamente con una respuesta predefinida, diseñada para ser rápida, clara e incluso un poco ingeniosa. Si no reconozco el patrón, entonces activo mis herramientas de búsqueda: genero representaciones vectoriales (embeddings) y busco los fragmentos más relevantes entre varios documentos —incluyendo el propio informe, archivos PDF y HTML externos, y sesiones de preguntas y respuestas (QA). A partir de esa información, creo un resumen que intenta ofrecerte una respuesta coherente y útil basada en el contenido existente.
Se debe tener en cuenta que este entorno es experimental. No utilizo grandes modelos de lenguaje, por lo que algunas respuestas pueden ser aproximadas o incompletas. El objetivo principal es facilitar una visualización rápida, comprensible y reproducible de la información contenida en los documentos, permitiendo una exploración más dinámica del informe.
Actualmente, los resultados pueden variar en precisión, ya que empleo modelos ligeros y locales para asegurar que la aplicación funcione en cualquier entorno sin necesidad de servidores externos. Sin embargo, la estructura del sistema está preparada para mejorar notablemente su rendimiento en el futuro mediante la integración con modelos más avanzados o APIs externas. Para comenzar, simplemente escribe tu pregunta en el campo inferior y deja que yo me encargue del resto. ¡Prometo poner todo mi código en ello!
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Esta sección describe el proceso de alineamiento de las secuencias de ARN ya preprocesadas al genoma de referencia, un paso crucial para poder cuantificar la expresión génica de forma precisa y contextualizada. El objetivo principal es determinar la ubicación exacta de cada lectura en el genoma, permitiendo así inferir qué genes están activos en cada muestra.
En primer lugar, se generó el índice del genoma de referencia utilizando la herramienta hisat2-build. Este índice es esencial para optimizar el rendimiento del alineamiento, ya que permite a la herramienta HISAT2 buscar de forma eficiente coincidencias entre las lecturas y el genoma.
A continuación, se realizó el alineamiento de las lecturas limpias contra el genoma indexado mediante HISAT2, obteniéndose como resultado principal archivos .bam por muestra, los cuales contienen las lecturas mapeadas y ordenadas. Junto a ellos, se generaron los correspondientes archivos de índice .bai para facilitar su visualización y manipulación, así como archivos .metrics que resumen las estadísticas de alineamiento.
Además, se conservaron los archivos .fastq.gz que contienen aquellas lecturas que no pudieron ser alineadas al genoma, lo que puede resultar útil para estudios posteriores como la búsqueda de elementos novedosos o el análisis de contaminantes.
Este conjunto de resultados sienta las bases para la siguiente etapa del análisis: la cuantificación de la expresión génica a partir de los alineamientos obtenidos.
Tabla de contenidos de esta sección
3. Alineamiento de las lecturas contra el genoma de referencia
Tras verificar la calidad de las lecturas mediante los análisis anteriores, el siguiente paso esencial en el flujo de trabajo de RNA-Seq es el alineamiento de dichas lecturas contra un genoma de referencia. Este proceso permite asignar cada secuencia a una posición específica del genoma, lo cual es imprescindible para interpretar correctamente la expresión génica y obtener resultados biológicamente significativos.
El alineamiento es una etapa crítica, ya que errores o ambigüedades en este paso pueden repercutir directamente en la cuantificación posterior y en la detección de genes diferencialmente expresados. Para llevarlo a cabo, se ha empleado el alineador HISAT2, una herramienta ampliamente utilizada en estudios transcriptómicos por su alta precisión, eficiencia computacional y capacidad para gestionar grandes volúmenes de datos.
HISAT2 está especialmente diseñado para datos de RNA-Seq y permite detectar empalmes (splicing) de manera efectiva, identificando lecturas que abarcan regiones exónicas separadas por intrones. Esta característica resulta fundamental para capturar la complejidad de la transcriptómica en organismos eucariotas.
En las siguientes subsecciones se detallan los pasos previos requeridos para el alineamiento, incluyendo la construcción del índice del genoma de referencia y la ejecución del proceso de mapeo con HISAT2.
3.1. Preparación del índice del genoma de referencia
Para llevar a cabo el alineamiento de las lecturas, es fundamental contar con un índice del genoma de referencia previamente construido. Este índice consiste en una estructura de datos optimizada que facilita la búsqueda rápida y eficiente de coincidencias entre las lecturas y el genoma, permitiendo a HISAT2 realizar alineamientos precisos incluso en regiones complejas del transcriptoma.
En el caso de HISAT2, el índice está compuesto por múltiples archivos con extensión .ht2, que contienen fragmentos de esta estructura de datos. Cada uno de estos archivos representa una parte del índice que juntos permiten la navegación eficiente del genoma durante el proceso de alineamiento.
En este proyecto, el índice fue generado a partir de la secuencia genómica de referencia seleccionada, y su construcción representa un paso clave para garantizar un procesamiento ágil, reproducible y eficiente.
El índice generado, en el momento de la generación de este informe, se encuentra ubicado en la siguiente ruta dentro de la estructura del proyecto:
/workspace/data/0101-EXT-25-Transcriptomics-Bulk-RNA-Seq/Analisis/mary/hisat2_index
A continuación, se muestran los archivos que conforman este índice, indispensables para que HISAT2 pueda realizar el alineamiento de manera efectiva:
Explorar los archivos de la carpeta “hisat2_index” aquí
3.2. Alineamiento de lecturas contra el genoma indexado
Una vez construido el índice del genoma de referencia, se procedió a realizar el alineamiento de las lecturas utilizando la herramienta HISAT2. Esta etapa es fundamental en el análisis de expresión génica, ya que consiste en mapear cada una de las lecturas obtenidas del secuenciador contra el genoma de referencia, determinando su ubicación exacta en el mismo.
El resultado de este alineamiento permite identificar con precisión las regiones del genoma que han sido transcritas, lo cual constituye la base para los análisis cuantitativos y funcionales posteriores.
Los archivos resultantes de este proceso se encuentran almacenados, en el momento de la generación de este informe, en el siguiente directorio:
/workspace/data/0101-EXT-25-Transcriptomics-Bulk-RNA-Seq/Analisis/mary/hisat2_results
Para cada muestra analizada, se generan varios archivos importantes que se describen a continuación:
.bam ⇒ archivos que contienen las lecturas alineadas, ordenadas y preparadas para su uso en cuantificación y análisis posteriores.
.bai ⇒ índices asociados a los archivos BAM, que facilitan el acceso rápido a regiones específicas dentro de estos archivos.
.metrics ⇒ archivos que resumen métricas relevantes del proceso de alineamiento, tales como porcentaje de lecturas alineadas, calidad y otros indicadores de desempeño.
_no_aligned_fasq.1.gz y _no_aligned_fasq.2.gz ⇒ archivos comprimidos que contienen las lecturas que no pudieron alinearse al genoma, lo que puede indicar lecturas de baja calidad, contaminación o secuencias no presentes en la referencia.
A continuación, se presenta una lista de estos archivos para las muestras que han sido procesadas correctamente:
Explorar los archivos de la carpeta “hisat2_results” aquí
Una vez comentado todo esto y finalizado el alineamiento de las lecturas con el genoma de referencia, el siguiente paso del análisis consistirá en la cuantificación de la expresión génica, la cuál trataremos en la siguiente sección. A lo largo de las próximas subsecciones se presentarán los resultados derivados de esta cuantificación, incluyendo visualizaciones preliminares de los recuentos, procesos de normalización y análisis estadísticos de la expresión diferencial y funcional.