IPBLN Bioinformatics Report

El proceso de análisis de RNA-Seq llevado a cabo en este estudio se sustenta en el uso del pipeline miARma‑Seq (Eduardo Andrés-León et al.), junto con el lenguaje de programación R, permitiendo realizar un flujo de trabajo completo y reproducible desde los archivos FASTQ hasta la obtención de resultados de expresión diferencial y análisis funcional.

La herramienta miARma‑Seq combina múltiples etapas fundamentales en un pipeline modular y configurable: control de calidad de lecturas, alineamiento al genoma de referencia, cuantificación de genes e isoformas, análisis de miRNA y circRNA, identificación de genes diferencialmente expresados y análisis funcional de enriquecimiento biológico. La herramienta genera reportes intermedios y finales que permiten evaluar la calidad de los datos en cada fase y garantizar resultados consistentes y reproducibles.

Gracias a su diseño modular, miARma‑Seq permite ejecutar todo el flujo de análisis de manera automática o seleccionar pasos específicos según las necesidades del estudio. Esto asegura que los resultados sean comparables entre experimentos y facilita la integración en entornos de análisis reproducibles mediante Nextflow y Quarto.

En los siguientes apartados se describen con detalle las principales etapas de ejecución de miARma‑Seq, incluyendo su configuración, el flujo de procesamiento de datos y los tipos de resultados obtenidos.

El proyecto de miARma‑Seq es un pipeline integral diseñado para el análisis de RNA‑Seq (mRNA, miRNA y circRNA), desarrollado por Eduardo Andrés‑León et al. y mantenido por el grupo de Bioinformática del IPBLN-CSIC. Esta herramienta permite realizar un flujo de trabajo completo y reproducible desde los archivos FASTQ hasta la generación de resultados de expresión diferencial y análisis funcional, integrando todas las etapas principales de análisis transcriptómico.

El pipeline incluye módulos modulares y configurables que permiten procesar los datos de manera escalable y flexible:

1. Control de calidad inicial ⇒ Evaluación de los archivos FASTQ mediante FastQC, con reportes individuales y resúmenes globales mediante MultiQC. Esto permite detectar adaptadores, sesgos de composición y problemas de calidad por posición.
2. Recorte de lecturas ⇒ Eliminación de adaptadores y bases de baja calidad usando Cutadapt o Reaper, optimizando los datos antes del alineamiento.
3. Alineamiento ⇒ Mapeo de lecturas al genoma de referencia utilizando alineadores como HISAT2, STAR, Bowtie o BWA, dependiendo del tipo de RNA y del organismo.
4. Cuantificación ⇒ Conteo de genes o isoformas con featureCounts, cuantificación de miRNAs con miRDeep2 y detección de circRNAs con CIRI.
5. Análisis diferencial ⇒ Identificación de genes, miRNAs o circRNAs diferencialmente expresados utilizando paquetes estadísticos como edgeR o NOISeq, adaptados al diseño experimental.
6. Análisis funcional ⇒ Predicción de interacciones miRNA‑mRNA, evaluación de correlaciones inversas de expresión y análisis de enriquecimiento funcional mediante Gene Ontology (GO) y KEGG.
7. Integración de datos y visualización ⇒ Generación de reportes intermedios y finales, incluyendo tablas de expresión, gráficos de expresión diferencial, correlaciones y análisis funcional, listos para su interpretación y comunicación científica.

Esta herramienta, está diseñada para ser totalmente modular y configurable, permitiendo ejecutar el flujo completo de manera automática o seleccionar pasos específicos según las necesidades del estudio. Esto facilita la integración en entornos reproducibles mediante Nextflow y la presentación de resultados en Quarto, garantizando trazabilidad, reproducibilidad y claridad en la interpretación de datos transcriptómicos.

Toda la documentación, módulos, parámetros y ejemplos de uso de miARma‑Seq están disponibles en su repositorio oficial en GitHub. A continuación se muestra de forma esquemática el workflow completo del pipeline para RNA‑Seq:

Para garantizar reproducibilidad y modularidad, miARma‑Seq utiliza un archivo de configuración con extensión .ini. Este archivo es fundamental, ya que contiene todos los parámetros necesarios para ejecutar cada módulo del pipeline (control de calidad, recorte de lecturas, alineamiento, cuantificación, análisis diferencial y análisis funcional) sin necesidad de introducir comandos complejos en la línea de comandos. En el contexto de este informe de Bulk RNA-Seq, el archivo .ini está configurado para ejecutar todo el flujo de análisis, asegurando que los resultados sean consistentes y reproducibles.

Así, para este informe, el archivo .ini utilizado se encuentra en el siguiente directorio:

/workspace/data/0101-EXT-25-Transcriptomics-Bulk-RNA-Seq/Analisis/miARma_workflow.ini.

Este archivo configura todos los módulos necesarios para el análisis completo de RNA-Seq y se puede consultar para verificar parámetros de control de calidad, alineamiento, cuantificación y análisis diferencial. Dicho archivo puede visualizarse mediante el siguiente iframe o, para más detalle, abrirse en una pestaña nueva haciendo click en el botón correspondiente. Además, es posible descargarlo mediante el botón específico ubicado junto al visor (para que la función de descarga funcione correctamente, se debe abrir el informe (index.html) mediante un servidor, tal como se indica en la pestaña de inicio).

Un archivo .ini en miARma‑Seq está organizado en secciones claramente definidas, como [General], [QC], [Aligner], [ReadCount], [DifferentialExpression] o [FunctionalAnalysis], cada una correspondiente a un módulo específico del pipeline de RNA-Seq. En cada sección se configuran parámetros esenciales, incluyendo:

• Rutas de entrada y salida de los archivos de secuencias y resultados intermedios.
• Tipo de RNA a procesar (mRNA, miRNA, circRNA) y organismo de referencia.
• Número de hilos o núcleos a utilizar para paralelización.
• Herramientas y opciones específicas para cada etapa (FastQC, Cutadapt, HISAT2, STAR, featureCounts, miRDeep2, CIRI, edgeR, NOISeq, etc.).
• Criterios de calidad, filtros de lectura y parámetros estadísticos aplicados en cada análisis.
• Configuraciones para generación de reportes, visualización y análisis funcional (GO, KEGG).

La ejecución del pipeline en un entorno de High-Performance Computing (HPC) se realiza mediante un archivo de script .sh, que automatiza la carga de módulos, la asignación de recursos (memoria y núcleos) y la ejecución de miARma‑Seq utilizando el archivo de configuración .ini.

Para este informe de Bulk RNA-Seq, el script Slurm.shempleado se encuentra en el siguiente directorio:

/workspace/data/0101-EXT-25-Transcriptomics-Bulk-RNA-Seq/Analisis/Slurm.sh.

Y podemos visualizarlo de forma similar mediante el siguiente iframe, así como prodecer con su respectiva descarga.

Gracias a esta estructura, es posible ejecutar de manera reproducible todo el flujo de análisis de RNA-Seq (mRNA, miRNA y circRNA), incluyendo control de calidad, recorte de lecturas, alineamiento, cuantificación, análisis diferencial y análisis funcional. La modularidad del pipeline permite activar o desactivar pasos específicos según las necesidades del estudio, integrando así un flujo de trabajo completo, escalable y reproducible.

Para más información sobre miARma‑Seq y su pipeline completo de RNA-Seq, se puede consultar el repositorio oficial en GitHub: miARma‑Seq.

Una vez completadas todas las etapas del flujo de análisis de Bulk RNA-Seq mediante miARma‑Seq, los resultados se organizan en una estructura de directorios que sirve como base para la generación de este informe automatizado. Esta organización incluye archivos intermedios, resultados finales y metadatos asociados a cada módulo del pipeline, garantizando la trazabilidad y la reproducibilidad del análisis completo.

Esta sección, al igual que el resto de la pestaña de metodología, tiene un propósito puramente técnico y está pensada como referencia interna para el usuario que generó el informe. Su objetivo es permitir comprender cómo se estructuran los datos de salida del proyecto, de modo que sea posible revisar rápidamente la organización de resultados sin necesidad de volver al entorno de análisis original.

A continuación se muestra la ruta del directorio principal donde se encuentran los datos y resultados generados para este proyecto:

/workspace/data/0101-EXT-25-Transcriptomics-Bulk-RNA-Seq

A continuación se muestra la estructura completa de dicho directorio. Esta representación permite visualizar los archivos y subcarpetas generados por miARma‑Seq y que se emplearon como base para la construcción del informe:

Explorar los archivos de la carpeta “0101-EXT-25-Transcriptomics-Bulk-RNA-Seq” aquí

Tras visualizar la estructura de forma interactiva, se presenta a continuación un desglose detallado de las carpetas y archivos generados durante el análisis de Bulk RNA-Seq para el experimento mary, perteneciente al proyecto 0101-EXT-25-Transcriptomics-Bulk-RNA-Seq. Esta organización está diseñada para facilitar la reproducibilidad del análisis, la trazabilidad de los resultados y su interpretación posterior.

Esta estructura modular y coherente no solo permite automatizar los pasos clave del análisis bioinformático, sino que también garantiza trazabilidad, reproducibilidad y facilidad de interpretación. Además, contribuye a una mejor documentación del flujo de trabajo, lo cual es especialmente útil en entornos colaborativos o proyectos de largo recorrido.

Una vez obtenidos los datos procesados mediante el workflow de miARma‑Seq y mostrada la estructura del directorio en el cuál se encuentran los resultados generados a partir de todo el proceso de análisis, el siguiente paso consiste en la generación automatizada del informe final. Esta sección tiene como objetivo documentar de manera clara y reproducible todo el proceso mediante el cual se construye el informe, detallando la organización de los archivos de ejecución, la integración de herramientas y la configuración utilizada.

En particular, se abordarán los siguientes aspectos:

• 3.1. Estructura del directorio de ejecución ⇒ Se mostrará la ubicación y organización de los archivos y carpetas desde los cuales se ejecuta el pipeline, incluyendo los scripts de Nextflow y los archivos asociados de Quarto. Esto permite al usuario técnico entender dónde se encuentran los datos, resultados intermedios y archivos de configuración necesarios para generar el informe.
• 3.2. Integración de Nextflow y Quarto ⇒ Se explicará cómo se ha utilizado Nextflow para automatizar la ejecución de Quarto y la generación del informe final, describiendo el rol de los scripts principales (main.nf) y cómo se coordinan las distintas etapas del pipeline.
• 3.3. Configuración del archivo _quarto.yml y params.yml ⇒ Se mostrarán los archivos de configuración que permiten reproducir el informe exacto, incluyendo rutas de entrada, parámetros de análisis y opciones de visualización. Esta documentación asegura que cualquier usuario técnico pueda regenerar el informe con los mismos resultados en el futuro, garantizando trazabilidad y reproducibilidad.

El propósito de esta sección es proporcionar un registro técnico completo del flujo de trabajo utilizado para generar el informe, de manera que cualquier persona que vuelva a consultar el proyecto pueda entender de forma clara cómo se ensamblaron los datos, qué herramientas se utilizaron y cómo se configuró todo el entorno de ejecución.

En esta subsección se describe la estructura de archivos y carpetas desde la cual se ejecuta el pipeline de metagenómica que genera el informe automatizado. Esta información es fundamental para entender cómo se organizan los datos de entrada, los resultados intermedios y los archivos de configuración de Quarto y Nextflow.

La ruta raíz desde la cual se ejecuta este pipeline es:

/workspace/GenoScribe/02-pipelines/01-transcriptomics/01-bulk-rna-seq

A continuación se presenta la estructura completa del directorio correspondiente a este proyecto. Es importante destacar que los elementos listados (tanto archivos como subcarpetas) no representan enlaces interactivos, sino que se muestran únicamente para ilustrar la organización interna de los contenidos. Esta representación permite al lector comprender de manera clara y visual cómo se distribuyen los distintos componentes del proyecto, facilitando la navegación conceptual del directorio sin necesidad de acceder directamente a cada archivo.

Explorar los archivos de la carpeta “01-bulk-rna-seq” aquí

A continuación se detalla la organización principal del directorio raíz del pipeline (01-bulk-rna-seq). Esta descripción está pensada como referencia técnica: indica qué hace cada archivo o carpeta, dónde se guardan los datos generados y cómo se conectan las piezas para producir el report final.

Una vez comentada la estructura general del directorio de ejecución, se puede señalar que el pipeline está organizado de manera modular para asegurar la reproducibilidad, la trazabilidad de los resultados y la claridad en la generación del informe. Los archivos .qmd representan las pestañas y subsecciones del informe, mientras que Nextflow se encarga de consolidar los resultados previos, generar reportes adicionales cuando es necesario y coordinar la ejecución de Quarto para producir el documento final.

Dentro de resources/01-essential/03-scripts/02-quarto se mantienen dos versiones de las plantillas: 01-full-version, que incluye la pestaña de metodología y todas las secciones detalladas de análisis, y 02-compact-version, que omite la pestaña de metodología y ofrece una versión más compacta del informe. Cada archivo .qmd corresponde a una pestaña o subsección específica.

Nextflow utiliza los resultados existentes del análisis metagenómico (control de calidad, abundancias y predicciones funcionales) almacenados en resources/02-nextflow-results/01-project-data/{nombre_del_proyecto} y realiza operaciones adicionales como la consolidación de resultados, generación de reportes MultiQC en 02-multiqc-report y preparación de datos estadísticos en 03-analisis-estadistico. Asimismo, genera los archivos de configuración que Quarto requiere, incluyendo params.yml y, mediante yaml_generator.py, _quarto.yml con los parámetros y rutas específicos del proyecto, para asegurar que la renderización del informe sea reproducible y consistente.

Para generar el informe, Nextflow invoca quarto render sobre los .qmd y los archivos de parámetros correspondientes, produciendo el HTML final en report/. Los scripts auxiliares en la raíz del proyecto, como run_pipeline_shell.sh, run_pipeline_shiny.sh y run_cleaning_dir.sh, permiten ejecutar el pipeline desde la terminal, mediante interfaz gráfica o limpiar caches y directorios temporales respectivamente.

Para reproducir un informe exacto, se requiere disponer de la copia completa de los resultados en resources/02-nextflow-results/01-project-data/{nombre_del_proyecto}, así como de los archivos params.yml y _quarto.yml generados durante la ejecución. Esta estructura modular facilita la localización de los archivos necesarios y asegura que cualquier usuario pueda reconstruir el informe de manera consistente.

Para detalles adicionales y pasos exactos de ejecución, se recomienda consultar la guía oficial del proyecto en GitHub: GenoScribe: Guía completa para el pipeline Transcriptómico de Bulk RNA-Seq.

La integración entre Nextflow y Quarto constituye la base técnica que permite generar de forma automatizada el informe final a partir de los resultados del análisis de RNA-Seq. Este enfoque busca asegurar reproducibilidad, modularidad y trazabilidad, evitando la dependencia de pasos manuales y reduciendo el riesgo de inconsistencias entre los resultados y la documentación generada. A diferencia de un pipeline clásico, en este caso Nextflow no ejecuta los procesos analíticos de miARma-Seq, sino que consume sus resultados ya generados, realiza operaciones intermedias necesarias (copias estructuradas, generación de reportes auxiliares, preparación de parámetros) y finalmente invoca Quarto para la construcción del informe.

El esquema general es el siguiente:

1. Se define un conjunto de parámetros y rutas base mediante nextflow.config.
2. Nextflow inicia el pipeline, copia los archivos esenciales del proyecto a una estructura de trabajo reproducible, y ejecuta procesos auxiliares como MultiQC sobre los reportes de control de calidad.
3. Se generan o actualizan los archivos de configuración que Quarto utilizará (params.yml y _quarto.yml).
4. Finalmente, se invoca quarto render para ensamblar el informe HTML final de manera completamente automatizada.

El archivo de configuración nextflow.config, ubicado en /workspace/GenoScribe/02-pipelines/01-transcriptomics/01-bulk-rna-seq/nextflow.config, es el punto de partida de esta integración. Define las variables globales del pipeline, incluyendo:

• outdir → Ruta de salida estándar donde se almacenarán los resultados y el informe final.
• project_path → Ubicación del proyecto analizado, que contiene la estructura de directorios generada previamente por miARma-Seq y QIIME 2.
• experiment_name → Especifica el nombre del específico del experimento analizado ya se puede dar el caso de que encontremos diversos carpetas relativas a distintos experimentos dentro del directorio raíz del proyecto.
• report_version → Define la versión del informe a generar (full o compact), lo cual condiciona las pestañas y contenidos que Quarto renderizará.

Una vez comentado esto, podemos visualizar dicho archivo mediante el siguiente iframe, así como explorarlo de forma más detallada en una página completa o descargarlo (hay que abrir el informe mediante un servidor para que esta acción funcione, como ya se ha mencionado).

El archivo main.nf, ubicado en /workspace/GenoScribe/02-pipelines/01-transcriptomics/01-bulk-rna-seq/main.nf, constituye el núcleo del pipeline y orquesta los diferentes procesos necesarios para la preparación del informe. Entre las etapas más relevantes que gestiona este script se incluyen:

• Copia estructurada de archivos del proyecto ⇒ Se seleccionan únicamente los elementos esenciales (sin archivos de gran tamaño como FASTQ o BAM) para trasladarlos a resources/02-nextflow-results/01-project-data/. Esto garantiza que Quarto trabaje sobre una estructura consolidada y ligera.
• Ejecución de MultiQC ⇒ A partir de los reportes de control de calidad (FastQC) generados en miARma-Seq, se ejecuta MultiQC para unificar la información y facilitar su visualización en el informe final.
• Preparación de parámetros para Quarto ⇒ A partir de las variables definidas en nextflow.config, se generan los archivos params.yml y _quarto.yml (este último, mediante yaml_generator.py), los cuales actúan como interfaz entre el pipeline y Quarto.
• Renderizado del informe ⇒ Cuando todos los procesos previos han finalizado satisfactoriamente, se invoca quarto render para construir el informe HTML en la carpeta report/. Esto asegura que el informe se genere siempre con datos completos y parámetros consistentes.

De igual modo, podemos visualizar este archivo mediante el siguiente iframe, así como explorarlo de forma más detallada en una página completa o descargándolo.

Este diseño modular permite ampliar o modificar el pipeline fácilmente sin comprometer su reproducibilidad. Al separar claramente las etapas de preparación de datos y la generación del informe, se facilita la trazabilidad de cada componente y se asegura que cualquier informe pueda ser reconstruido en el futuro a partir de los mismos parámetros y estructura de resultados.

Una vez ejecutado el pipeline de Nextflow, se generan los archivos de configuración _quarto.yml y params.yml. Estos archivos constituyen la interfaz entre el pipeline y Quarto, permitiendo que el último paso del flujo de trabajo ejecute quarto render y construya el informe HTML final a partir de los datos y parámetros proporcionados.

El archivo params.yml contiene todos los parámetros específicos de la ejecución, incluyendo rutas de archivos, opciones de visualización, marcador analizado, versión del informe y metadatos relevantes del proyecto. Por su parte, _quarto.yml establece la estructura del informe, definiendo las plantillas, pestañas, secciones a renderizar y rutas internas, mediante la ejecución del script yaml_generator.py. Juntos, estos archivos permiten que la generación del informe sea completamente automatizada, consistente y reproducible.

A continuación se puede visualizar params.yml mediante un iframe, explorar su contenido de manera interactiva, o abrirlo en una página completa y descargarlo si se desea:

Una vez comprendido el contenido de params.yml, se puede observar _quarto.yml, que actúa como guía estructural para Quarto, indicando qué plantillas y secciones deben incluirse y cómo deben organizarse dentro del informe. Este archivo es esencial para que quarto render genere un documento final coherente con los datos del proyecto.

Esta arquitectura garantiza que cualquier informe pueda ser reproducido en el futuro de manera exacta, siempre que se disponga de los mismos resultados consolidados en resources/02-nextflow-results/01-project-data/nombre_del_proyecto y de los archivos params.yml y _quarto.yml generados por el pipeline. La separación clara entre la preparación de datos y la generación del informe asegura trazabilidad, modularidad y consistencia en los reportes finales.

Esta sección final cierra la pestaña de metodología, dirigida principalmente a usuarios interesados en comprender en detalle cómo se ha generado el informe, qué datos se han utilizado y cómo se ha estructurado la integración entre Nextflow y Quarto. La información aquí proporcionada permite acceder a recursos adicionales, consultar la documentación técnica y localizar los repositorios de código para revisar o reutilizar los scripts empleados.

De manera similar a las tarjetas de inicio, se presentan a continuación algunas tarjetas informativas que facilitan el acceso rápido a los recursos clave relacionados con este proyecto:

Para cualquier duda adicional o consultas de soporte, se puede recurrir a los datos de contacto que se muestran en la pestaña de inicio del informe, donde se incluyen enlaces a la Unidad de Bioinformática del CSIC y al correo de soporte.